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浙江大学高分子科学与工程学系刘建钊课题组在Nat. Chem. Biol.发表关于细胞转录组信使RNA m6A单碱基分辨率测序成果

日期:2020-04-28 10:10

  

教科书上知识告诉我们,生物大分子DNARNA都是由四种基本碱基单元组成:DNA含有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T),而RNA则是将胸腺嘧啶替换为了尿嘧啶(U)(1)。

 

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                图1. 生物大分子DNARNA的基本组成与化学结构

 

但是随着近几十年来的研究发现在DNARNA的碱基上存在着一些天然化学基团修饰,DNA修饰种类较少,RNA修饰较丰富,他们在调控生物体细胞内基因表达方面发挥重要的作用。分子生物学中心法则中间层次信使RNAmRNA)上已被鉴定含有多种化学碱基修饰(21,其生物学功能还在不断的探索和挖掘中。然而,随即而来的重要科学问题是我们如何鉴定这些化学修饰的碱基在RNA上的精确位置,这是研究其生物学意义的分子基础。

 

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            2. mRNA上的转录后化学修饰及其在mRNA上的分布(图片来源Nat Rev Mol Cell Biol


在迄今为止已经鉴定的150多种RNA化学修饰中,m6AN6-甲基腺嘌呤)修饰是哺乳动物细胞信使RNA (mRNA)内部丰度最高的碱基化学修饰 (3-5 m6A/mRNA),其生物学功能研究也最为广泛,近乎影响RNA代谢寿命过程中的每一个环节,包括转录、剪接、降解、翻译和运输等。这些研究成果的取得都得益于m6A检测和测序技术的发展, 为了深入理解m6A甲基化的功能,单碱基分辨率信息是必需的,它能在碱基层次上帮助我们理解细胞内甲基化的机理和功能。

2020427日,浙江大学高分子科学与工程学系刘建钊课题组在Nature Chemical Biology上长文发表题为A metabolic labeling method detects m6A transcriptome-wide at single base resolution的研究,报道了一种称为m6A-label-seq的高通量测序方法,通过细胞自身代谢对全转录组RNA m6A位点进行标记,进而实现单碱基分辨率测定。

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细胞内S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是甲基转移酶的辅助因子,可在mRNA m6A甲基转移酶(METTL3/METTL14)的作用下,将其甲基转移到mRNA上的特定腺嘌呤的N6位点形成m6ASAM是以甲硫氨酸和三磷酸腺苷(ATP)为原料,在甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT)的催化下合成的。作者从甲基化源头考虑,引入带有烯丙基修饰的甲硫氨酸,在细胞内MAT作用下生成烯丙基取代的辅助因子allyl-SAM或者硒代同源物allyl-SeAM (3) 细胞内METTL3/METTL14利用allyl-SAMallyl-SeAM,将其烯丙基修饰到mRNA上原本是m6A的位点,得到a6AN6-烯丙基腺嘌呤),a6A在温和的碘加成条件下诱导生成环化1,6位环化腺嘌呤(cyc-A) (3),然后,RNA cyc-A在逆转录成互补DNAcDNA)时发生碱基错配2 最后,借助高通量测序和生物信息学分析突变位点,得到了全转录组m6A位点的单碱基分辨率图谱。

 

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      图3. 示意图描述利用代谢标记测定RNA m6A精确位置的方法(图片来源Nature Chemical Biology

 

刘建钊课题组利用m6A-label-seq方法对人体HeLaHEK293T细胞系以及老鼠H2.35细胞系的mRNA m6A位点、位点距离、m6A共有基序等信息进行了系统分析。结果显示部分检测到的m6A修饰位点倾向于成簇出现,相邻m6A位点之间的中位距离约为50 nt(图4a)。并且,对AC/T/G的突变位点进行序列分析,绝大部分共有序列为GGAC,与之前报道的m6A序列相符(图4b)。此外,以HeLa细胞为例,选取了FRAT2ZNF445LATS111种基因的14个位点,展示了高通量测序下的突变位点,该位点即为m6A位点(图4c)。研究人员还对选取的位点进行了低通量方法测序验证,以此确认这些位点的可靠性(图4d)。 

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         图4. m6A-label-seq用于高通量测序鉴定m6A位点(图片来源Nature Chemical Biology

 

为了进一步确认该方法的有效性,研究人员还将m6A-label-seqmiCLIP-seqm6A-REF-seqDART-seq等已知测序数据进行了对比,分析了各种方法之间鉴定的mRNA m6A位点重叠和差异比例情况。最后,研究人员选取了16m6A特征位点,用独立正交的SELECT3 m6A鉴定方法验证了这些位点的可靠性。

 

综上,该研究的测序方法特点如下:(1)利用代谢对甲基化位点的源头标记并直接单碱基分辨率测定,相对于当前的间接方法有更高的准确率;(2)适用于细胞内RNA多种不同甲基化序列(motif)的鉴定;(3)对测定m6A簇修饰有优势。该方法为将来研究细胞核内种类繁多的新生RNAm6A甲基化位点及状态演变提供了重要工具。另外,该方法在标记产率和标记时间窗口尺度方面还需要优化提高,为研究更多的细胞事件过程提供便利。

 

浙江大学高分子科学与工程学2017级直博生舒潇与2016级直博生曹婕同学为本论文的共同第一作者,刘建钊研究员为通讯作者。通讯作者同时也是浙江大学生命科学研究院兼职PI

 

原文链接:https://www.nature.com/articles/s41589-020-0526-9

 

参考文献

1. Lewis, C., Pan, T. & Kalsotra, A. RNA modifications and structures cooperate to guide RNA–protein interactions. Nat Rev Mol Cell Biol 18, 202–210 (2017).

2. Shu, X. et al. N6-allyladenosine: a new small molecule for RNA labeling identified by mutation assay. J. Am. Chem. Soc. 139, 17213-17216 (2017).

3. Xiao, Y. et al. An elongation- and ligation-based qPCR amplification method for the radiolabeling-free detection of locus-specific N6-methyladenosine modification. Angew. Chem. Int. Ed. 57, 15995-16000 (2018).

 




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